1. INTRODUCCIÓN
Desde el redescubrimiento de las leyes de Mendel la mejora de las plantas
de cultivo dejó de ser meramente empírica y se convirtió en científica.. Las
variedades se seleccionan por ciclos de polinización cruzada (hibridación) y
selección. Se han ido creando variedades selectas que han terminado
desplazando a las antiguas. Por ejemplo, el trigo de invierno es
prácticamente la única variedad empleada en Occidente para la fabricación
del pan.
Luego vino la introducción de la mecanización en la agricultura, junto con
la aplicación de productos químicos (fertilizantes, plaguicidas, herbicidas).
La Revolución Verde (años 60), con sus nuevas variedades híbridas y sus
prácticas intensivas con abonos y pesticidas llevaron a grandes aumentos de
producción en muchos países que antes tenían graves problemas de
suministros de alimentos (China, India, partes de Latinoamérica).
Estamos entrando en una nueva era de la agricultura, de la mano de las
nuevas biotecnologías (BT), con un papel central de la genética molecular.
Ello se ha debido a un auge espectacular de los conocimientos básicos de
biología vegetal y a la aplicación de las técnicas de Ingeniería Genética
(I.G.).
A partir de ahora, la "revolución" agrícola va a depender menos de
innovaciones mecánicas o químicas, y va a estar basada en un uso intensivo de
saber científico y de técnicas moleculares y celulares.
Aunque la BT agropecuaria ha tardado en arrancar (ya estaba en marcha la
I.G. aplicada a la producción de fármacos), su desarrollo está siendo
espectacular, y se esperan grandes innovaciones con repercusiones
comerciales en los próximos lustros.
Promesas de la BT agrícola:
aumentar productividad y reducir costes
innovaciones y mejoras en los alimentos
prácticas agrícolas más "ecológicas".
Pero además la manipulación genética de plantas tendrá un impacto en otros
sectores productivos:
floricultura y jardinería
industria química
industria farmacéutica
La punta de lanza y parte más espectacular de esta BT es la I.G. de plantas: la
creación de plantas transgénicas a las que hemos introducido establemente
ADN foráneo que puede ser no sólo de origen vegetal, sino de animales o de
microorganismos.
Pero no podemos olvidar que la BT vegetal es más amplia, incluyendo otras
técnicas, pero todos estos nuevos métodos a su vez sirven para que los
programas tradicionales de mejora genética se realicen más racionalmente,
con más efectividad y en menor tiempo.
Algunos de los avances de la BT vegetal:
Proyectos genoma de arroz (como modelo de monocotiledóneas) y de
Arabidospis thaliana (modelo de dicotiledóneas). Se están obteniendo datos
moleculares y genéticos sobre procesos básicos de las plantas. (por
ejemplo, biología del desarrollo y diferenciación de órganos). Identificación
de genes responsables de rasgos complejos, muchos de ellos de importancia
agronómica.
Clonación (aislamiento) de genes, que luego servirán para hacer I.G.,
introduciéndolos en otras plantas.
La mejora tradicional se ha basado (y lo seguirá haciendo) en la obtención,
evaluación y selección de alelos valiosos. Lo que aporta la BT es, p. ej.,
marcadores moleculares que permiten rastrear la segregación de estos
alelos de una forma más rápida, racional y efectiva, por lo que los
programas de mejora tradicional se ven potenciados.
Juegos de marcadores moleculares, repartidos por el genoma, y para los
que se suele recurrir a la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR):
RFLP
RAPD (ADN polimórficos amplificados aleatoriamente)
AFLP (polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados)
Esto ya se está haciendo en muchas especies, incluso en leñosas (árboles).
Conforme estos métodos se vayan automatizando, los programas serán más
rápidos.
Además, su uso está aportando datos evolutivos valiosos: p. ej., la mayor
parte los genomas de cereales poseen sintenia (colinearidad de su
organización genómica), con claros indicios de eventos de reordenaciones. Lo
que se descubra en una especie (p. ej., arroz) podrá investigarse fácilmente
en otra. Incluso puede que cuando entendamos mejor la base genéticoevolutiva
de las diferencias adaptativas de los diferentes cereales, podamos
los humanos hacer "evolución artificial", creando nuevas especies adaptadas a
nuestros intereses.
La obtención de plantas transgénicas (manipuladas por I.G.) depende de la
introducción (normalmente en cultivos de tejidos) de ADN foráneo en su
genoma, seguido de la regeneración de la planta completa y la subsiguiente
expresión de los genes introducidos (transgenes).
Normalmente, para que un gen pueda funcionar en la planta, hay que hacer in
vitro una "construcción genética artificial": para ello se suele colocar delante
de la parte codificadora que nos interesa una porción de ADN que permite esa
expresión (promotores, intensificadores de la transcripción).
Podemos incluso escoger nuestros promotores: algunos inducen la expresión
en casi todos los tejidos de la planta, de forma continua (constitutiva); en
cambio, otros logran que el transgén se exprese sólo en determinados órganos
o tejidos, o bajo el efecto inductor de alguna sustancia química.
El florecimiento de la IG vegetal se debe principalmente a dos grandes
avances de la década de los 80:
protocolos experimentales para la regeneración de plantas completas
fértiles a partir de cultivos de células o tejidos in vitro;
métodos para introducir el ADN exógeno, bien sea de modo directo o
indirecto, seguido de su inserción en el genoma y su expresión.
Regeneración de plantas a partir de cultivos
En principio se intentó a partir de protoplastos, pero es laborioso y no
funciona con muchas plantas
A partir de discos foliares
Pero en los últimos 10 años hemos aprendido a hacerlo mejor: la clave del
éxito consiste en extraer porciones de tejidos inmaduros (explantes), que
siguen conservando su potencial morfogenético (totipotencia) y cultivarlos
en medios nutritivos suplementados con mezclas de dos tipos de hormonas
vegetales: auxinas (que tienden a inducir crecimiento de raíces) y
citoquininas (inducen caulogénesis). Lo que se obtiene en principio es un
cultivo embriogénico que forma el llamado embrión somático. Éste retiene
el potencial morfogenético durante mucho tiempo. De este embrión se
puede a su vez regenerar plantas completas normales y fértiles.
Esto ha permitido que actualmente se puedan regenerar casi todas las plantas
de interés agrícola: cereales, leguminosas, hierbas forrajeras, caña de azúcar,
papaya, plátano, etc.
Métodos de transformación genética
Perlitas microscópicas de oro o tungsteno se recubren del ADN de interés, y se
disparan a gran velocidad con una pistola especial. Las células en la línea
directa del proyectil pueden morir, pero a su alrededor muchas células captan
el ADN sin daños.
Incluso se pueden transformar cloroplastos con este sistema.
Sirve para plantas que son más difíciles de cultivarse sus tejidos (cereales,
leguminosas), aunque tiene el inconveniente de que el ADN puede insertarse
en copias, y puede ser inestable.
El ADN se mezcla con protoplastos, y se aplican corrientes elevadas, lo que
provoca la entrada de aquél.
Microbalística (biolística)
Electroporación
Co‐cultivo de células o tejidos con Agrobacterium tumefaciens
La biología de esta bacteria
Agrobacterium tumefaciens del suelo que lleva haciendo ingeniería genética
por su cuenta con las plantas desde hace millones de años. Nosotros hemos
aprendido a aprovechar sus extraordinarias habilidades.
La bacteria es un patógeno de plantas, induciéndoles una malformación
llamada tumor de la agalla. Establece con la planta una especie de
"colonización genética" que obliga a la planta a fabricar una sustancia de la
que sólo se puede nutrir esta bacteria. El tumor es una especie de fábrica
de esas sustancias, para el solo beneficio de Agrobacterium.
La bacteria es atraída por sustancias que la planta excreta en sus zonas
abiertas por pequeñas heridas. Por allí se introduce, quedando en los
espacios intercelulares, y es entonces cuando transfiere a la célula vegetal
un trozo de su material genético: una porción de un plásmido (ADN circular
extracromosómico bacteriano), que se integrará en alguna zona del genoma
de la planta.
Descripción del plásmido Ti:
ADN‐T, que es lo único que se transfiere. Posee borde izquierdo, borde
derecho, gen de biosíntesis de hormona vegetal, gen de síntesis de opina.
genes vir que provocan la transferencia del trozo T.
genes de catabolismo de opinas (que permiten que la bacteria se nutra de
estas sustancias).
El ADN‐T entra al núcleo y se inserta al azar en algún sitio del genoma. Allí
se expresan sus dos genes: el de las hormonas provoca crecimiento
descontrolado de las células vegetales (de ahí el tumor); el otro obliga a
esas células a fabricar grandes cantidades de opinas, una sustancia que la
planta no puede aprovechar; y la excreta.
Así pues, las bacterias se encuentran con un nicho ideal para nutrirse y
multiplicarse: la planta se ha convertido en una especie de esclava
metabólica que mantiene el crecimiento de la bacteria en el seno del tumor
de la agalla.
Vectores a partir del plásmido Ti
Suelen ser de uno de dos posibles tipos:
vectores binarios
vectores recombinativos (cointegrativos)
En esencia, hemos "vaciado" el interior del ADN‐T, dejando de él sólo los
bordes (imprescindibles), y lo hemos sustituido por dos genes: uno es un
marcador para localizar o seleccionar las células que se hayan transformado;
el otro es el gen que queremos poner a trabajar en la planta.
Ahora introducimos nuestro vector (con la correspondiente construcción
genética) en una cepa de Agrobacterium a la que hemos "desarmado" su
plásmido Ti (con objeto aprovechar sus funciones de transferencia del ADN‐T,
pero inactivándole sus funciones patógenas).
Ejemplo de uso: introducción del gen Bt que determina la toxina
antiiinsecticida de la bacteria Bacillus thuringiensis .
Recientes progresos con vectores de Agrobacterium
Hasta hace muy poco este sistema no se podía aplicar a monocotiledóneas.
Pero recientemente, se ha logrado en:
arroz (aunque de una variedad ‐Japonica‐ que no es tan interesante como la
Indica)
maíz
Esto es importante, porque las monocotiledóneas son esenciales, sobre todo
en países en desarrollo, y porque este sistema es más fiable que otros (más
estable, una sola copia del transgén). Si en el futuro esto se amplía a trigo,
cebada, etc., se habría dado un gran paso en la mejora de cereales.
Método para transformar la planta entera (no hay que recurrir al más
tedioso sistema de cultivo in vitro):
Las semillas de la planta se mezclan con la bacteria y se procede a la
germinación y crecimiento del vegetal: parece que quedan bacterias
retenidas hasta que al llegar la floración transmiten el ADN‐T al zigoto.
Otro método consiste en sumergir plantas a punto de florecer en un cultivo
fresco de Agrobacterium, y aplicar vacío.
En ambos casos se espera a tener las semillas, se germinan, crecen, se
autofecundan, y producen nuevas semillas, a partir de las cuales se pueden
buscar los genotipos/fenotipos de interés.
TIPOS DE MANIPULACIONES
Aditivas: el gen introducido codifica una nueva función.
Sustractivas: el ADN introducido bloquea a un gen de la planta.
antisentido
interruptor a distancia (transwitch)
Durante los primeros años, la IG de plantas era aditiva: añadía uno o dos
genes concretos. Pero tiene la limitación de que existen pocos genes
individuales que logren mejoras por sí solos (resistencia a virus, a larvas de
insectos, a ciertos herbicidas...)
Desde mediados de los 80 se comenzó la estrategia sustractiva: el ADN que se
introduce inhibe o bloquea de alguna manera la expresión de un gen de la
planta (p. ej. anular algún gen de algún rasgo no deseado).
Tecnología antisentido
Ejemplo: Inhibición gen de la poligalacturonasa en tomate: retrasa la
maduración.
Insertamos un gen en orientación opuesta a la normal, lo que determina un
ARN (antisentido) que se empareja con el ARN del gen homólogo normal de
la planta. Ello parece que dificulta la traducción de este ARNm por los
ribosomas, y favorece su degradación. De esta manera se puede anular o
inhibir el fenotipo dependiente del gen que se quiere controlar.
Tecnología del interruptor a distancia (transwitch)
Ejemplo: supresión del gen CHS en petunia, lo que produce flores blancas o
variegadas.
Introducir trozos del gen a bloquear, pero en su orientación normal, lo cual
interfiere con el procesamiento del ARN del gen homólogo completo de la
planta.
Estas técnicas de silenciamiento génico permiten obtener gamas desde casi
total anulación de la expresión hasta valores intermedios, dependiendo de la
posición del transgén.
Veamos ejemplo de estas manipulaciones sustractivas para retrasar la
maduración excesiva de los frutos.
1. Inhibiendo la poligalacturonasa (PG)
Estrategia de Calgene para su Tomate FlavrSavr ™, que ya se vende en
los EEUU.
Gen antisentido bloquea al gen endógeno de PG. En ausencia de PG no
hay degradación de las cadenas de poligalacturónico de la piel del
tomate, por lo que sigue conservando su aspecto fresco varias semanas
después de cosecharlo. Los demás aspectos de la maduración (los
positivos) no se modifican. Se puede dejar el tomate en la mata más
tiempo sin miedo a que se estropee luego, y ello permite que pasen
más sustancias que confieren sabor y hacen el fruto más apetecible.
La empresa Zeneca ha hecho algo parecido, pero con técnica
transwitch.
2. Controlando la ruta biosintética del etileno
El etileno es una hormona vegetal gaseosa que controla muchos
procesos (germinación, senescencia y caída de hojas y flores, respuesta
al estrés, etc.). En cierto tipo de frutos (climatéricos) controla, además
su maduración: al inicio de ésta el aumento de etileno induce cambios
en color, textura, aroma y sabor, que hacen que el fruto sea
apetecible.
El problema: frutos que se estropean y hay que tirarlos porque no aguantan
lo suficiente hasta llegar al consumidor (En el tercer mundo esto supone
50% pérdidas) Esto actualmente se resuelve cortándolos de la mata cuando
aún están verdes. Pero con ello se pierde sabor y otras cualidades valiosas.
En tomate se ha logrado retrasar la maduración regulando dos procesos
distintos:
Control por bloqueo del gen de la ACC sintasa o de la ACC oxidasa). Cuando
se inhibe el 95% de la ACC oxidasa, el fruto madura sólo sus cualidades
positivas, pero se evita el reblandecimiento y estropeado. El fruto se recoge
y se mantiene más tiempo. Si queremos darle su aspecto normal, antes de
venderlo lo gaseamos con etileno.
Esto mismo se ha logrado este año con el melón de raza Canteloupe (piel
amarilla): el melón lo podemos dejar en la mata sin absición, madurando
más lentamente, con lo que mejora su sabor. Se puede recoger con la
corteza verde, pero si queremos venderlo con su aspecto amarillo, lo
gaseamos con etileno. Aguanta más tiempo una vez recolectado: lo
podemos guardar en buen estado más tiempo, y permite transportarlo a
mayores distancias.
